妇产科

双胎妊娠胎儿游离DNA比例及其影响因素研究

作者:吕远、于文倩、尹少尉、刘彩霞 来源:国实用妇科与产科杂志 日期:2017-06-01
导读

         1997年,Lo等首次报道了在孕妇血浆中存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA),cffDNA占孕妇血浆中游离DNA总量的10%以上,且会在孕妇分娩后很快降解。随着测序技术的不断发展,2008年Chiu等首次利用高通量测序(high-throughput sequencing)技术对cffDNA进行检测,由此实现了胎儿非整倍体疾病无创性的检测。

关键字:  双胎妊娠 

        中国母胎医学、重庆围产联合《中国实用妇科与产科杂志》微信平台共同发布

        吕远、于文倩、尹少尉、刘彩霞,中国医科大学附属盛京医院妇产科,辽宁省母胎医学重点实验室

        1997年,Lo等首次报道了在孕妇血浆中存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA),cffDNA占孕妇血浆中游离DNA总量的10%以上,且会在孕妇分娩后很快降解。随着测序技术的不断发展,2008年Chiu等首次利用高通量测序(high-throughput sequencing)技术对cffDNA进行检测,由此实现了胎儿非整倍体疾病无创性的检测。

        目前,基于检测cffDNA的无创DNA产前筛查(non-invasive prenatal DNA screening,NIPS)技术已广泛应用于单胎妊娠的非整倍体检测,为保证筛查结果的准确性及敏感度,目前需要的胎儿游离DNA的比例至少达到4%。近年来,随着妊娠年龄不断增加及辅助生殖技术的发展,双胎及多胎妊娠发生率逐年升高,已至少占全球新生儿的3%。然而,具有更安全更快速优势的无创DNA筛查在双胎中的应用依然存在难度,这主要是因为母体血浆中同时存两个胎儿的游离DNA,并且难以区分,例如当出现双胎中一胎畸形时,如果患儿的cffDNA比例达不到NIPS的最低值,就会出现假阴性的结果。一般来说,同卵双胎因其相同的遗传背景,适用于4%的单胎最低检测浓度标准;但是,4%的单胎最低检测浓度标准却不适用于异卵双胎。已有部分文献报道,NIPS在双胎妊娠中的敏感度和特异度较单胎妊娠低,容易造成假阴性。导致该结果的原因之一就是由于异卵双胎中异常胎儿的cffDNA比例达不到检测的最低要求。确认双胎妊娠的孕妇血浆中cffDNA的比例是检测的前提,但相关的数据仍然尚少。因此,本研究对双胎妊娠的孕妇血浆进行了高通量测序检测,利用妊娠男-男双胎的样本进行cffDNA比例的估算,并分析cffDNA的比例与孕周和筛查时的孕妇体重指数(BMI)的关系。

1 资料与方法

        1.1 研究对象 选择2015-10-01—2016-08-31于中国医科大学附属盛京医院产科产检并自愿接受NIPS的双胎孕妇469例。纳入标准如下:(1)11~30周双胎妊娠孕妇,通过辅助生殖技术妊娠的双胎孕妇因考虑其早期流产或胎停的风险较大从而导致后期失访,因此,其筛查孕周大于18周。(2)抽血时孕妇体重<100 kg。(3)夫妻双方染色体均无明确的异常。(4)孕妇1年内未接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或免疫治疗等。通过分娩后的随访,我们选取了其中71例男-男双胎的孕妇进行后续数据统计,孕妇年龄22~54(32.11±5.06)岁。入组孕妇自然受孕36例(50.7%),辅助生殖技术受孕35例(49.3%)。根据孕早期超声诊断并经过妊娠终止时胎盘的回顾性确认,其中单绒毛膜(简称单绒)双羊膜囊(简称双羊)双胎31例(43.7%),双绒毛膜(简称双绒)双羊双胎40例(56.3%)。本研究已经通过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准,所有参与研究的孕妇均签署知情同意书。

        1.2 高通量测序检测抽取孕妇外周血10 mL,在4℃,离心力1600 g条件下离心10 min后,取上清分装到2.0 mL离心管中,剩余沉淀含孕妇白细胞,留存备用。初步分离后的上清在4℃条件下以离心力16 000 g再次离心10 min,取上清分装到2.0 mL离心管中,取部分血清立即提取DNA,剩余部分放入-80℃冰箱保存备用。将提取的血浆游离DNA,按照DA8600测序平台及配套经国家食品质量监督检验中心认证的检测试剂盒的标准流程进行扩增、文库制备及高通量测序检测。

        1.3 数据统计分析 所有测序数据均通过TMAP软件比对人类基因组参考序列(版本:NCBI Build37/hg19),同时,我们使用DA8600测序平台自带的BamDuplicates命令对比对结果进行去重复序列分析。经以上步骤分析后,提取比对质量值(MAPQ)大于10且序列长度大于35 bp作为惟一匹配序列,并使用局部加权回归方法对得到的惟一匹配序列进行GC校正,最终计算得到GC校正后的Y染色体百分比。胎儿游离DNA比例约等于Y染色体百分比。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

        2.1 双胎胎儿游离DNA在母体血浆总DNA中所占比例对71例男-男双胎的Y染色体百分比进行计算,并估算出双胎妊娠母体血浆中cffDNA比例为5%~30%,绝大部分(71.8%)在10%~20%区间,单绒双羊双胎和双绒双羊双胎之间未见明显差异,见图1。

        图1 双胎胎儿游离DNA比例值分布区间

        2.2 双胎cffDNA比例与孕周及孕妇BMI的关系 利用高通量测序生成的数据得到71样本中cffDNA的比例,并与孕周及孕妇抽血时的BMI进行数据统计(见表1-2)。经过线性拟合分析,双胎cffDNA比例与孕妇的孕周呈较强的正相关性(r=0.71),即孕妇的孕周越大其相对应的胎儿DNA比例越高(见图2);cffDNA比例与孕妇BMI呈较强的负相关性(r=-0.78),即孕妇BMI越高其相对应的胎儿DNA比例越低(见图3)。

        表1 不同孕周孕妇外周血cffDNA百分比

        图2 胎儿游离DNA百分比与孕周的关系

        表2 不同BMI孕妇cffDNA百分比

        图3 胎儿游离DNA百分比与孕妇BMI的关系

3 讨论

        3.1 双胎胎儿游离DNA的比例分布 近年来,以检测母体血浆中cffDNA为基础的无创产前检测手段在筛查胎儿染色体非整倍体中展现出较高的准确度与特异度。孕妇外周血中存在胎儿游离DNA,虽然这些游离DNA被称作胎儿DNA片段,但是,实际上这些DNA来源于凋亡的胎盘滋养层细胞,片段长度一般在150 bp左右,但重要的是,这些片段被证实包含了整个胎儿基因组。在单胎中,胎儿游离DNA一般占血清总DNA的10%~20%,这些DNA最早在妊娠4周的时候即可被检测到,而且在孕期相对稳定,因此,可以用来进行检测。孕妇本身并无Y染色体,因此,cffDNA的比例一般用男胎的Y染色体百分比来衡量,在双胎中,只有在两胎都是男胎的情况下,Y染色体的百分比才可以代表全部cffDNA比例。我们的研究结果显示,双胎的cffDNA比例在孕11~30周可达到5%~30%,全部超过了单胎检测需要的4%的最低值。因此,对于单卵双胎孕妇,在接受以cffDNA为基础的检测方法时(如NIPS),可获得与单胎孕妇同样的准确度与敏感度。但是对于异卵双胎的孕妇,检测的结果需要谨慎对待。

        3.2 双胎胎儿游离DNA比例与孕周的关系 本研究分析了孕周对双胎cffDNA比例的影响,发现其比例与孕妇的孕周呈较强的正相关性,这与文献中报道的单胎妊娠中cffDNA与孕周的关系一致。随着孕周的增加,胎盘体积的增大,凋亡的胎盘滋养层细胞增多,因此,释放到孕妇外周血液中的DNA片段增加,导致胎儿游离DNA的比例增加。假设双胎的游离DNA比例检测的理论最低值是单胎的2倍,即8%,从我们的数据可以看到,在孕18周后,cffDNA比例的最低值都在10%以上,所以,对于异卵双胎,我们的结果建议,孕妇18周后再接受基于胎儿游离DNA的相关检测,以便得到更加准确的结果。

        3.3 双胎胎儿游离DNA比例与孕妇BMI的关系 本研究结果还提示,双胎cffDNA的比例与孕妇BMI呈较强的负相关性。孕妇体重的增加将导致其外周血浆中胎儿游离DNA的稀释,比例下降。虽然我们的结果显示,双胎cffDNA比例与孕妇BMI呈负相关,但即使是在BMI达到32的时候,cffDNA比例的平均值也在10%以上,这个比例是单卵双胎游离DNA检测理论最低值的2.5倍。由于本研究纳入的双胎孕妇体重都在100 kg以内,所有孕妇的BMI均在19~32之间,因此,对于单卵双胎孕妇,其BMI的上限还需要更多的数据来确认。对异卵双胎孕妇而言,建议其尽量降低BMI,以提高cffDNA的比例,获得更好的检测效果。

        本研究利用男-男双胎妊娠孕妇外周血中的Y染色体浓度估算了双胎胎儿游离DNA的比例,并发现其与妊娠孕周呈正相关,与孕妇BMI呈负相关。我们的数据将为基于双胎胎儿游离DNA的相关检测技术提供理论依据。

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